Рисунок 2а. Схема строения пептидогликана. Он представляет собой полимер, в котором чередуются аминогексозы (N-ацетилглюкозамин и N-ацетилмурамовая кислота), сшитые через остатки N-ацетилмурамовой кислоты короткими пептидными «мостиками». Каждый такой мостик состоит из пяти аминокислот, из которых две концевые — D-изомер аланина (D-аланил-D-аланин).
Пенициллины, как и все β-лактамные антибиотики , вызывают гибель бактерий. Другими словами, они обладают бактерицидным действием. β-лактамный антибиотик, будучи структурным аналогом концевого дипептида пептидогликана D-аланил-D-аланина, ковалентно связывается с активным сайтом (местом присоединения фермента к субстрату) ПСБ. Такое связывание ингибирует реакцию транспептидирования и останавливает синтез пептидогликана (рис. 4). В результате таких нарушений барьера бактериальная клетка становится осмотически неустойчивой и в конце концов разрушается [5] . Интересно, что данный класс антибиотиков (впрочем, как и многие другие) практически не имеет серьезных побочных эффектов, поскольку пептидогликан и ПСБ отсутствуют у эукариот. Нельзя не подчеркнуть, что β-лактамные препараты (впрочем, как и другие препараты, влияющие на синтез клеточной стенки) убивают бактерий только в том случае, когда те активно растут и синтезируют клеточную стенку (ведь «зрелые» бактерии уже образовали свою клеточную стенку, и антибиотику попросту уже не на что влиять!) Сделала Экспресс Тест
Что за зверь такой, липид-II? Начальные этапы синтеза пептидогликана проходят в цитоплазме клетки бактерии, а транспорт его компонентов (NAM с пентапептидом и NAG) через цитоплазматическую мембрану осуществляется специальным переносичком — ничем иным, как липидом-II (вы, скорее всего, уже не раз слышали про него в других работах). Эта транспортная молекула (рис. 5), обладающая амфифильными свойствами (благодаря которым она может свободно «курсировать» между цитоплазмой и периплазматическим пространством сквозь ЦПМ), предоставляет ферментам-«строителям» дисахарид-пентапетидные мономеры, чтобы те осуществили «сборку» пептидогликана [9] .
Рисунок 7. Механизмы действия циклосерина, фосфомицина и бацитрацина. Фосфомицин действует на самых ранних этапах образования клеточной стенки. Он подавляет цитоплазматический фермент енолпируваттрансферазу, блокируя присоединение фосфоенолпирувата к UDP-N-ацетилгюкозамину (предшественнику NAM). Циклосерин является структурным аналогом аминокислоты D-аланина. Этот препарат ингибирует включение D-аланина в пентапептид муреина путем подавления активности двух ферментов: аланинрацемазы (превращающающей L-аланин в D-аланин) и D-аланил-D-аланинлигазы (сшивает D-аланил-D-аланин). Бацитрацин, обладающий бактерицидным действием, связывается с активной фосфорилированной формой переносчика, в результате чего не происходит дефосфорилирование липида-II, то есть регенерация его свободной формы. В таком случае не могут осуществиться начальные стадии синтеза пептидогликана, в которых задействован липидный переносчик.
Трансляция — синтез полипептидной цепи на рибосомах, направляемый мРНК. Бактериальная рибосома состоит из трех типов рибосомных РНК (рРНК): 16S (входит в состав малой 30S субъединицы), 23S и 5S (входят в состав большой 50S субъединицы), а также из множества различных рибосомных белков. Процесс трансляции проходит в три этапа: инициация, элонгация, терминация.
После того, как вторая «заряженная» аминоацил-тРНК (тРНК, несущая аминокислотный остаток) занимает А-сайт, начинается следующая стадия процесса — элонгация. В ней участвует пептидилтрансфераза — фермент, катализирующий образование пептидной связи между аминокислотами. Когда фермент формирует пептидную связь, мРНК передвигается внутри рибосомы на три нуклеотида, инициаторная тРНК освобождается от аминокислоты и продвигается в E-сайт, после чего покидает рибосому, а несущая образованный пептид вторая тРНК сдвигается из А-сайта в P-сайт — совершает транслокацию. Затем новая «заряженная» аминокислотой аминоацил-тРНК входит в А-сайт и цикл повторяется.
Циклов элонгации происходит очень много, пока на мРНК не встречается один из нонсенс-кодонов (UAG, UAA, UGA) — наступает стадия терминации. Такой стоп-кодон завершает трансляцию, и новосинтезированная полипептидная цепь покидает рибосому (рис. 9).
Рисунок 9. Синтез белка (трансляция) у бактерий. Инициация начинается с формирования инициирующего комплекса (структура, состоящая из малой 30S субъединицы рибосомы, молекул инициирующих факторов (IF1, IF2, IF3), формилметиониновой (fMet) тРНК и собственно транслируемой мРНК). Затем с комплексом связывается большая 50S субъединица. Элонгация стартует с того, что «заряженная» аминокислотой тРНК занимает А-сайт. Между аминокислотами образуется пептидная связь, а затем происходит транслокация. Элонгация — цикличный процесс, таких «кругов» проходит много, пока не наступает последний этап — терминация, который завершает синтез полипептидной цепи на нонсенс-кодоне.
Рисунок 10. Механизм действия тетрациклинов (tet) и тигециклина (tig). Тетрациклины и тигециклин обратимо связываются с малой 30S субъединицей бактериальной рибосомы (а если точнее, то с ее 16S рРНК). Это вызывает блокирование связывания аминоацил-тРНК («заряженной» тРНК) с А-сайтом комплекса «мРНК—рибосома». В итоге такое действие тетрациклинов предотвращает добавление аминокислот к растущей цепи и, соответственно, останавливает синтез белка.
Внутри клетки молекулы препарата необратимо связываются со специфическими белками-рецепторами на 30S субъединице рибосом (если точнее, то с 16S рРНК и рибосомальным белком S12), изменяя при этом конформацию А-сайта [25] . Это приводит к ингибированию синтеза белка (рис. 12) [26] .
Рисунок 13. Точки приложения антибиотиков (описанных в данной статье), влияющих на синтез белка. Условные обозначения: Ami — аминогликозииды; Tet — тетрациклины; Tig — тигециклины; Cam — хлорамфеникол; Lin — линезолиды; Oxz — оксазолидиноны; Mac — макролиды; Str — стрептограмины; Ket — кетолиды.
Группа фторхинолонов обладает бактерицидным действием. Они блокируют синтез бактериальной ДНК за счет ингибирования ферментов — бактериальной топоизомеразы II (ДНК-гиразы) и топоизомеразы IV [30] . Ингибирование ДНК-гиразы предотвращает расслабление (релаксацию) положительно суперскрученной ДНК, что необходимо для процессов транскрипции и репликации. Это, соответственно, влияет на рост, деление и жизнедеятельность бактериальной клетки. Ингибирование топоизомеразы IV нарушает расхождение материнской и реплицированной хромосомных ДНК в соответствующие дочерние клетки во время деления [31] , [32] .
Начиная с 40-х годов XX века, эффективность и безопасность антибиотиков сильно возросли, вследствие чего заболеваемость и смертность от инфекционных заболеваний упала в разы. К несчастью, вместе с этим стали возникать микроорганизмы, устойчивые к данным препаратам (очень подробно про эту проблему вы можете прочитать в статье « Антибиотикорезистентность: How to make antibiotics great again? » [34] из спецпроекта «Биомолекулы» об АБР). Однако бактериальный резистом — пул генов, определяющих устойчивость, — в действительности появился задолго до возникновения фарминдустрии [35] . Первоначально он сформировался в процессе эволюции для противостояния бактерицидным соединениям естественного происхождения, и только потом стал стремительно меняться за счет того, что бактерии начали взаимодействовать с современными антибактериальными агентами [36] . Короткое время генерации, то есть смены поколений, многих бактерий служит огромным преимуществом для таких эволюционных адаптаций [37] . Явление резистентности налагает серьезные ограничения в выборе лечения многих бактериальных заболеваний. Бактерии становятся устойчивыми к антибиотикам в двух ситуациях:
Многие микроорганизмы образуют ферменты, химически инактивирующие молекулы антибактериальных препаратов. β-лактамазы — классический пример таких ферментов. Они гидролизуют β-лактамное кольцо в составе, как ни странно, β-лактамных антибиотиков. Представители данной группы ферментов — пенициллиназа и цефалоспориназа — нарушают структуру антибиотиков пенициллиннового и цефалоспоринового рядов соответственно, вследствие чего молекулы препаратов теряют свою активность (рис. 18). При этом перекрестная устойчивость полностью не развивается — ферменты специфичны в отношении своих субстратов. Было идентифицировано более 100 разновидностей этих ферментов. Некоторые из них, например, продуцируются бактериями Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae и Escherichia coli, что ограничивает применение данных антибиотиков при инфекциях, вызванных данными возбудителями. Другой вид β-лактамазы — AmpC, синтезирующийся бактериями Pseudomonas aeruginosa, — гидролизует и пенициллины, и цефалоспорины. Карбапенемы устойчивы к таким видам β-лактамаз, однако восприимчивы к металло-β-лактамазам и карбапенемазам. Например, недавно в Индии появились штаммы (несущие R-плазмиду с комплексом генов blaNDM), устойчивые к карбапенемам за счет выработки металло-β-лактамаз [54] .
Некоторые бактерии имеют специальные ферменты — транслоказы, «встроенные» в плазматическую мембрану. Чаще их называют эффлюкс-помпами, и они буквально выкачивают из клетки молекулы антибактериальных агентов. Эти помпы — белки, закодированные в плазмидах или хромосомах. Такие эффлюкс-насосы удаляют молекулы за счет протон-движущей силы (рис. 19). Они обеспечивают резистентность как многим Г+ микроорганизмам (Staphylococcus, Streptococcus), так и Г− (Pseudomonas, E. coli). Данный механизм АБР очень эффективен для микроорганизмов, поскольку обеспечивает устойчивость сразу к нескольким классам антибиотиков — так называемые полирезистентные (multidrug resistance) помпы [57] . Например, многие грамотрицательные микроорганизмы устойчивы к тетрациклинам за счет того, что имеют гены tet(A–E), которые и определяют синтез эффлюкс-помпы [18] . Кроме того, насосы обладают низкой селективностью; они могут выкачивать не только различные виды антибиотиков, но и другие токсичные для клетки вещества. Такой вид защиты бактерии очень часто применяют в отношении макролидов, стрептограминов и β-лактамных антибиотиков.
Устойчивость к пенициллинам у Streptococcus pneumoniae (стоит отметить, что такая устойчивость обусловлена приобретением кусков хромосомной ДНК от других бактерий рода Streptococcus посредством трансформации) и к метициллину у Staphylococcus aureus обусловлена изменениями в пенициллинсвязывающих белках. Важно, что сам метициллин в полной мере не «обезвреживается» β-лактамазами; однако, к несчастью для нас, произошла хромосомная мутация гена, кодирующего дополнительный β-лактам-связывающий белок, в результате чего появился штамм, устойчивый ко многим β-лактамам и другим препаратам, в том числе и к метициллину — метициллин-резистентный золотистый стафилококк (MRSA) (рис. 20) [58] .
Энтерококки приобрели устойчивость к ванкомицину через похожие изменения в белках клеточной стенки. Их пенициллин-связывающие белки имеют низкую аффинность ко многим β-лактамам. Устойчивость энтерококков к ванкомицину обусловлена их способностью модифицировать терминальную часть (D-аланил-D-аланин) «пептидного мостика» NAM так, что концевой D-аланин заменяется на D-лактат или D-серин. В результате этого теряется критически важная водородная связь, определяющая высокую аффиность ванкомицина к его мишени [59] . Данный механизм устойчивости, которым, к сожалению, «поделились» энтерококки, представлен также у ванкомицин-резистентного золотистого стафилококка (VRSA).
В 2015 году появилась еще одна тревожная новость — в Китае обнаружили E. coli, устойчивых к колистину, несущих R-плазмиду с геном mcr-1. До этого момента не было известно ни одного случая плазмид-опосредованной устойчивости к полимиксинам [60] !
Большинство Г+ микроорганизмов, имеющих ген tet(M), синтезируют специальный белок, который препятствует связыванию антибиотиков тетрациклинового ряда (но не тигециклина) с рибосомой. Модификация рибосомного сайта на 50S-субъединице, или т.н. «рибосомальная протекция», осуществляется либо за счет его мутации, либо синтеза метилаз, в результате чего возникает устойчивость к макролидам [61] . Метилазы кодируются большой группой r-генов erm. Эти ферменты присоединяют метильные группы к сайту-мишени так, что его аффинность к молекулам препарата уменьшается. Кроме того, такое изменение мишени обеспечивает перекрестную резистентность к структурно непохожим, но схожим по механизму действия соединениям, таким как клиндамицин и стрептограмин B (т.н. макролид-линкозамид-стрептограмин-, или МЛС-устойчивость типа B), которые разделяют один и тот же рибосомный сайт связывания.