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Scientific Reports volumen 10, número de artículo: 4421 (2020) Citar este artículo Suspensión oral de albendazol al 2,5 %
![Efectos del tratamiento con enrofloxacino sobre la microbiota bacteriana de la leche de cabras con mastitis persistente |Informes Científicos](http://cdn.globalso.com/lihuapharma/cdsvd13.png)
La resistencia a los antibióticos se ha convertido en una gran preocupación para la salud humana y animal.Dado que las fluoroquinolonas se han utilizado ampliamente en la medicina humana y veterinaria, también se ha producido una rápida aparición y propagación de resistencia a los antimicrobianos en todo el mundo.Aquí, analizamos el microbioma de la leche de cabra utilizando muestras de cabras sanas y aquellas diagnosticadas con mastitis persistente y tratadas con el antibiótico enrofloxacina con secuenciación del amplicón 16S rRNA.Seleccionamos un grupo de 11 cabras y 22 muestras de leche que no respondieron clínicamente al tratamiento con enrofloxacino.Se evaluaron muestras de leche antes y después del tratamiento para verificar cambios en la microbiota;las tres primeras cabras lactantes fueron seleccionadas del grupo de control sano.Las muestras de leche de los animales de control sanos presentaron una mayor abundancia de diferentes especies de bacterias del género Staphylococcus, pero un número menor de géneros diferentes, lo que indicó un nicho más específico de bacterias residentes.El filo Firmicutes fue predominantemente diferente entre los grupos estudiados.Las muestras de los animales antes del tratamiento tenían un mayor número de especies nuevas que las del grupo de control y después de ser tratados nuevamente.Esta microbiota recibió nuevas bacterias, aumentando aún más las diferencias de bacterias en relación con el grupo de control.Genotipos como Trueperella y Mannheimia, entre otros géneros, tuvieron una alta abundancia en las muestras de animales con mastitis persistente.La disbiosis en este estudio, con marcada evidencia de una microbiota compleja en actividad en casos de fracaso del tratamiento antimicrobiano para la mastitis crónica persistente, demuestra la necesidad de mejorar la precisión de la identificación de patógenos y aumenta la preocupación con respecto a los tratamientos con antibióticos en los rebaños de producción de leche.
Se ha demostrado que las terapias antimicrobianas son cada vez más problemáticas debido al desarrollo de múltiples tipos de mecanismos de resistencia a los antimicrobianos (RAM) y, por esa razón, las alternativas terapéuticas para tratar microorganismos resistentes a múltiples fármacos están disminuyendo rápidamente.Las fluoroquinolonas se han utilizado ampliamente en medicina humana y veterinaria, ya que se consideran entre los fármacos más eficaces para el tratamiento de infecciones bacterianas1,2.
La enrofloxacina, es una fluoroquinolona desarrollada exclusivamente para uso en medicina veterinaria1,3,4.Este fármaco es un potente inhibidor de la ADN topoisomerasa II (Girasa) bacteriana y de la ADN topoisomerasa IV (Topo IV), que son enzimas esenciales involucradas en procesos celulares clave, incluida la replicación del ADN5,6,7,8,9,10.El fármaco tiene un amplio espectro de actividad, siendo activo contra las principales bacterias patógenas (tanto Gram positivas como Gram negativas), micoplasmas11 y también micobacterias12, pero es ineficaz contra anaerobios obligados13.
Además, tanto en especies de mamíferos como de no mamíferos, el enrofloxacino se metaboliza parcialmente en el hígado a ciprofloxacino, uno de cuyos metabolitos principales es el ciclopropilo, un potente agente antimicrobiano en sí mismo14.El principio activo se caracteriza por una baja toxicidad para el huésped, no es mutagénico y tiene una vida media terminal de 2 a 6 h1,11,15.Además, de los agentes antimicrobianos comúnmente utilizados en el tratamiento de la mastitis, las fluoroquinolonas se distribuyen bien en una glándula mamaria inflamada16,17,18 y la enrofloxacina ha demostrado una alta biodisponibilidad y una excelente penetración en los tejidos en cabras15,19,20.
Sin embargo, la resistencia a las fluoroquinolonas sigue ocurriendo a un ritmo cada vez mayor en numerosas especies bacterianas y su uso varía en todo el mundo.Por lo tanto, las técnicas independientes del cultivo son esenciales para determinar los organismos que están presentes en una muestra determinada y permitir la evaluación y utilización de la riqueza genética que representan.La metagenómica representa una herramienta poderosa para lograr estos objetivos utilizando enfoques basados en secuencias y funcionales6,21.
La mastitis, o inflamación de la glándula mamaria22,23, es causada principalmente por una infección bacteriana intramamaria (IMI).La IMI es la enfermedad más relevante de los pequeños rumiantes y causa graves pérdidas económicas a la industria láctea en todo el mundo24,25.Varios patógenos bacterianos pueden causar IMI, pero Staphylococcus spp.son los microorganismos causales más frecuentemente diagnosticados de IMI en cabras y ovejas26.Otros patógenos como Streptococcus spp., Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Mannheimia haemolytica, Corynebacteria y hongos pueden producir IMI en pequeños rumiantes, pero las tasas de aparición son menores.La alta diversidad de microorganismos, principalmente bacterias causantes de IMI, son difíciles de tratar y controlar en medicina humana y veterinaria26,27.La disbiosis, definida como una ruptura en el equilibrio entre supuestos comensales microbianos y patógenos, demuestra que la alteración de la microbiota contribuye a la patogénesis de la mastitis y a la diseminación de la RAM a través de la leche25,28,29,30,31.Sin embargo, el uso de antimicrobianos puede alterar la microbiota comensal de la leche que tiene un papel protector de la glándula mamaria31,32.
En la leche humana y en la leche de diferentes rumiantes se ha identificado un microbioma específico de la glándula mamaria33,34,35.La producción de leche de cabra (Capra hircus) es de gran importancia para la economía de muchos países y ofrece muchos beneficios para la salud36,37,38,39,40;esta leche ha demostrado una alta diversidad microbiana en estudios41,42 y su consumo ha demostrado beneficios potenciales para la microbiota intestinal43.Pocos estudios han revelado la microbiota en la leche de cabra;sin embargo, los principales filos bacterianos encontrados son Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes y una variedad de géneros con Acinetobacter, Agrobacterium, Bacteroides, Bacillus, Enterobacter, Massilia, Micrococcus, Pseudomonas, Phyllobacterium, Rhodococcus, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Stenotrophomonas y Streptococcus41,42 .
La mayoría de los casos de IMI son IMI crónicos y persistentes (PIMI), que son difíciles de tratar y propensos a resurgir y, por lo tanto, a menudo van acompañados de un tratamiento antibiótico costoso y duradero y un sacrificio prematuro22,27,44,45.La mastitis en pequeños rumiantes, especialmente cabras, a menudo persiste durante la lactancia y los períodos secos, y la reinfección es común46.La infección PIMI puede estar relacionada con el proceso de RAM, en el que la bacteria es capaz de evadir la eliminación de los antibióticos y del sistema inmunológico del huésped, lo que resulta en infecciones persistentes y duraderas44,47.La resistencia a los antimicrobianos aumenta el riesgo de una posterior invasión del microbioma por parte de patógenos y de enfermedades posteriores48.
Los análisis de la microbiota con el uso de antibióticos en tratamientos profilácticos de mastitis en vacas31, así como tratamientos terapéuticos49, han dejado dudas sobre la eficiencia para reducir o eliminar bacterias patógenas en el microbioma de la leche.Sin embargo, aún es necesario determinar el conocimiento de la microbiota de los patógenos asociados a la leche de cabra en IMI y el impacto del uso de enrofloxacino en casos de PIMI.
Los objetivos de este estudio fueron generar conocimiento del microbioma de la leche de cabra utilizando muestras de cabras sanas y diagnosticadas con PIMI tras el tratamiento con el antibiótico enrofloxacino, caracterizado por secuenciación del amplicón 16S rRNA.Específicamente, se llevó a cabo para: (a) describir el microbioma de la leche de cabra de controles sanos, antes y después del tratamiento de IMI;(b) comparar las poblaciones microbianas de los grupos de tratamiento y de control sanos para evaluar el impacto de la enrofloxacina en la leche de mastitis;(c) realizar perfiles funcionales predictivos de comunidades microbianas y comparar los perfiles metabólicos y funcionales de las bacterias.
Se seleccionaron 25 muestras de leche de cabra, tres muestras de controles sanos (H), 11 muestras de antes del tratamiento (B) y 11 muestras de después del tratamiento (A) de los mismos animales, que mostraron persistencia clínica y bacteriológica cuando fueron tratados adecuadamente por síntomas clínicos. mastitis en otro estudio50 con el antibiótico enrofloxacino 1,4,19,51.Las 22 muestras, A y B, discernieron profundamente los cultivos microbiológicos y se identificaron que tenían múltiples microorganismos.Tres muestras de H no mostraron crecimiento bacteriológico en el medio de cultivo.De los 13 antibióticos probados, la enrofloxacina fue el único antibiótico identificado como eficaz para el tratamiento mencionado en la metodología (Fig. 1).
Flujo de trabajo experimental.Descripción del proceso de desarrollo del estudio, con las indicaciones del flujo de trabajo.Las letras en azul (H) corresponden a controles sanos, (B) a antes del tratamiento y (A) a después del tratamiento con enrofloxacino.Las flechas negras corresponden al flujo de trabajo hasta la finalización de los resultados.
Las CMI oscilaron entre 0,125 y 16 μg/ml en los aislados antes del tratamiento (B), mientras que en los aislados después del tratamiento (A), las CIM antimicrobianas oscilaron entre 0,19 y 16 μg/ml, y solo las muestras M1 y M2 mostraron 16 µg/mL.
Se recolectaron y secuenciaron un total de 25 muestras de leche de cabra en la región V4 del gen 16S rRNA;Las lecturas filtradas por calidad se demultiplexaron y se utilizó un total de 680.858.000 secuencias para análisis posteriores (media = 27.234.320 ± DE = 11.734.822 lecturas/muestra).La longitud media de todas las lecturas fue de 254 pb.En total, en los análisis se utilizaron 871 taxones identificados.
Se utilizaron cuatro tipos diferentes de bases de datos para realizar la clasificación taxonómica;Se eliminaron las variantes de secuencia de amplicones (ASV) que no cumplieron con el propósito de este estudio, como se informó anteriormente.La Tabla S1 demuestra la distribución de clasificación de la leche de cabra en nuestro estudio, y la base de datos Silva mostró la mejor clasificación taxonómica (Tabla S1).
Se analizaron la riqueza y la diversidad para evaluar si se observó alguna divergencia entre los grupos.Los índices de Chao 1 y Shannon no fueron estadísticamente diferentes entre los grupos de tratamiento (Fig. S1).Los resultados de las curvas de rarefacción (Fig. S1A) y la comparación pareada de diversidad alfa (Fig. S1B) no presentaron significaciones estadísticas para la diversidad alfa y la riqueza; sin embargo, existe una posible y aparente diferencia en la riqueza (Fig. S1A). .Por lo tanto, al analizar gráficas de curvas raras individualmente (Fig. S1A), los datos demuestran una menor riqueza de especies para el grupo H;seis muestras aumentaron la riqueza del grupo B respecto al grupo A, tres disminuyeron y dos se mantuvieron prácticamente en el mismo nivel de riqueza.
Las composiciones de la microbiota, a nivel de filos, se muestran en la Fig. 2. En comparación, Firmicutes tuvo la proporción más alta y presentó una diferencia significativa (P = 0,030) en su comparación pareada, como se muestra en la Fig. S2 (ANOVA, P < 0,05).Las pruebas post hoc indicaron una diferencia entre B y H, P = 0,006.El resto de filos, aunque no mostraron diferencias significativas entre taxones, presentaron diferentes proporciones entre grupos (Fig. 2), como Actinobacteria y Firmicutes, que fueron más abundantes en el grupo A, y Bacteroidetes, Fusobacteria y Proteobacteria, que fueron más abundantes. en el grupo B.
Composición de la microbiota bacteriana, a nivel de filo, entre grupos de tratamiento.( a ) Composición taxonómica del filo y taxones bacterianos diferencialmente abundantes entre los grupos después del tratamiento (A) y antes del tratamiento (B) y los controles sanos (H), divididos a nivel de filo, con cada color correspondiente a un filo diferente.(b) Filo de composición taxonómica agrupado en términos de abundancia en el grupo de tratamiento, correspondiendo cada color a un filo diferente.
La exploración de datos, presentada por los géneros a continuación (Fig. 3a), mostró que H tenía una gran abundancia de Staphylococcus sp., Bacteroides sp., Alkalibacterium sp., Shewanella sp.y Yersinia sp.(Fig. 3).El género Staphylococcus sp.mostró una abundancia relativa decreciente de H a A y, en consecuencia, a los grupos B.Esta diferencia en Staphylococcus sp.la abundancia fue significativa cuando H se comparó por separado con A y con B, como se demuestra en la Fig. S3 (prueba t no paramétrica de White, P <0,05).Los géneros más abundantes entre los grupos fueron Trueperella sp., Bacteroides sp., Staphylococcus sp., Alkalibacterium sp., Mannheimia sp., Yersinia sp., Fusobacterium sp., Escherichia sp./Shigella sp., Streptococcus sp., Geobacillus sp. ., Shewanella sp., Hydrogenophillis sp.y Klebisiellla sp.(Fig. 3).
Composición de la microbiota bacteriana, a nivel de género, en el grupo de muestras de leche antes del tratamiento (antes del tratamiento) y 14 días después del tratamiento (grupos persistentes): (a) Composición taxonómica de género y taxones bacterianos diferencialmente abundantes en los 14 días posteriores al tratamiento (A), antes del tratamiento (B) y grupo de control sano (H), divididos a nivel de género, correspondiendo cada color a un género diferente.(b) Composición taxonómica del género y taxones bacterianos relativos diferencialmente abundantes en las diferentes muestras antes del tratamiento representado por el número (1) y 14 días después del tratamiento representado por el número (2).Las muestras presentadas como HO son diferentes controles sanos (H) y los animales de cada grupo están representados por diferentes letras del alfabeto.
Las muestras B1-B2 mostraron un aumento significativo (prueba G + prueba de Fisher, P <0,01) en la abundancia de Trueperella sp.género después del tratamiento con enrofloxacina.Por otra parte, el género Mannheimia sp.mostró una disminución leve pero no significativa en la abundancia, junto con apariciones de niveles bajos de abundancia de varias otras bacterias en el microbioma de la muestra (Fig. 3b).
En la Fig. 2a, b, se puede ver que la abundancia de los filos Fusobacteria y los géneros Fusobacterium en el grupo B es mayor que la de los grupos A y H, lo que muestra que la acción de los antibióticos puede reducir o cambiar su abundancia, directa o indirectamente.Existen otros agentes como Staphylococcus sp., que ocupan el espacio dejado en la microbiota, que pueden haber bloqueado el retorno al equilibrio de la microbiota en un estado clínico saludable (HO).Sin embargo, el resultado de CIM mostrado arriba para las muestras M1 y M2 puede explicar la reducción de Fusobacterium spp.y el aumento de Staphylococcus spp.en la figura 3b.La técnica de clasificación en sí no pudo distinguir Escherichia sp./Shigella sp.géneros en este estudio.Estos resultados confirman la compleja etiología bacteriana de la mastitis en cabras.
La distribución de estos géneros entre grupos se puede visualizar mejor en un diagrama de Venn (Fig. 4).En el diagrama de Venn se enumeran todos los taxones de las bacterias pertenecientes a cada grupo de tratamiento, así como sus intercalaciones entre grupos.Algunos de los géneros ensamblados aparecen repetidamente en los mismos grupos y en otros, debido a la aparición de la clasificación de género que ocurre a través del paquete de tuberías 'DADA2', que realiza la distinción de variantes de secuencia por tan solo un nucleótido, lo que determina esta alta distinción mejor.
Gráfico de Venn con los grupos de árboles B, A y H, con el marco distribuido para cada género.Los grupos de tratamiento se distribuyeron equitativamente en diferentes colores, así como sus intercalaciones, correspondiendo H a controles sanos, B a antes del tratamiento con enrofloxacino y A a después del tratamiento con enrofloxacino.Los marcos a los lados del diagrama de Venn están identificados con los colores de su respectiva agrupación de la figura central de Venn e identifican cada género que ha sido catalogado para sus grupos.Los números delante de los géneros diferencian una bacteria de otra, ya que este género reaparece, pero con posibles especies y subespecies diferentes.
El grupo H tuvo el mayor número de géneros bacterianos (38) distintos de los demás grupos o en interrelaciones;el grupo A tuvo el segundo mayor número con 12 y el grupo B tuvo tres.El número de géneros que estuvieron presentes en los tres grupos de tratamiento (H, B, A) fue 16, mientras que los de H y B fueron seis, B y A fueron seis, y H y A fueron dos géneros.Por lo tanto, había más bacterias del grupo H correlacionadas con el grupo B que del grupo H correlacionadas con el grupo A.En términos del gráfico de diversidad beta (Fig. 4), hubo una disimilitud significativa entre las muestras H y A, lo que corrobora la distinción que ocurrió en A con enrofloxacino de H. El género Staphylococcus sp.apareció con mayor frecuencia entre los grupos.
Al comparar B, A y H, los grupos que presentaron diferencias significativas fueron A–H (Adonis; R2 = 0,10 y P = 0,02), lo que demuestra que la distribución y abundancia de los dos grupos fueron diferentes (Fig. 5).Por lo tanto, no pudimos observar ninguna separación entre A–B y B–H, pero sí una marcada separación entre los grupos A–H (Fig. 4), lo que denota que el tratamiento (A) provocó un mayor alejamiento del perfil del residente. microbiota (H).
Diversidad beta basada en la disimilitud de Bray-Curtis y escalamiento multidimensional no métrico.Diversidad beta gráfica con análisis de coordenadas principales de la comunidad microbiana basado en la distancia de Bray-Curtis entre los grupos de tratamiento en la microbiota láctea: antes del tratamiento (B), después del tratamiento (A) y control de salud (H), mediante escalamiento multidimensional no métrico ( NMDS).La posición de las muestras en la ordenación NMDS representa el orden de clasificación de las distancias entre muestras, que denota la similitud entre A – B y B – H, y la disimilitud entre A – H (Adonis; R2 = 0,10 y P = 0,022).
En el gráfico de diversidad beta (Fig. 5), la diferencia significativa entre los grupos H y A contextualiza los resultados evidenciados para los mismos grupos en el diagrama de Venn (Fig. 4), en el que observamos solo dos bacterias en el grupo HA.
A continuación, analizamos las vías funcionales predichas en cada muestra perteneciente al grupo persistente, anotadas utilizando la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) en los grupos de ortología KEGG de Nivel 2 y Nivel 3 que eran significativamente diferentes entre H, B y A. Las diferencias de composición en abundancia, en términos de máximos y mínimos entre las muestras, fueron 13 rasgos detectados en L3 (Fig. 6) y otros cuatro rasgos detectados en L2 (Fig. S4).
Las características funcionales microbianas en diferentes muestras de leche de cabra, pertenecientes a los grupos persistentes en abundancia relativa KEGG Nivel 3. Predicción de la función de la microbiota de la leche de cabra a partir de controles sanos (azul) y los grupos persistentes antes del tratamiento (verde) y después tratamiento (rojo) en las vías KEGG Nivel 3, transformado en abundancias relativas.La comparación de la abundancia de vías predichas se realizó utilizando los programas PICRUST y STAMP.Se seleccionaron vías significativas mediante un ANOVA (P <0,05), con una prueba de Tukey-Kramer (0,95).
Las características básicas de KEGG en L2 fueron el metabolismo energético, las enfermedades infecciosas, las enzimas de restricción y las proteínas relacionadas con la transcripción (Fig. S4).Las características más destacadas y significativamente abundantes relacionadas con el análisis de Nivel 3 fueron el metabolismo del metano y el metabolismo del butanoato, que demostraron características de menor abundancia en el grupo H en relación con los grupos A y B (Fig. S5).
La RAM es uno de los principales problemas de salud pública que está creciendo rápidamente en todo el mundo52 y va acompañada de una disminución en el descubrimiento de nuevos agentes antimicrobianos53.El desarrollo de la resistencia a los antimicrobianos plantea preocupaciones relacionadas con la seguridad alimentaria, ya que puede conducir a una disminución en la disponibilidad de antibióticos para su uso en animales de producción y, por lo tanto, limitar la capacidad de los profesionales para controlar enfermedades en animales criados para la producción de alimentos49.Nuestros datos revelaron la diversidad y riqueza de la microbiota en la leche de cabra, contrastando y comparando los principales patógenos en situación de persistencia de mastitis en un rebaño de cabras tratadas con el antibiótico enrofloxacino.
Si bien los grupos no presentaron diferencias en cuanto a los índices de diversidad alfa, el análisis de la diversidad de la microbiota fue algo complicado, ya que las interacciones entre ambiente, microbioma y huésped son dinámicas, y además, la adición de un antimicrobiano será necesaria. otro factor de distorsión en esta dinámica54.En este sentido, varios estudios sobre antibióticos y diversidad alfa han presentado resultados diferentes.Por ejemplo, en estudios de tratamientos de vacas con antibióticos, los índices de diversidad de Shannon y riqueza de Chao1 no fueron significativamente diferentes entre los animales que recibieron un antibiótico (clorhidrato de ceftiofur intramamario) y sellador de pezones o sellador de pezones solo31.Por el contrario, otro estudio identificó una mayor diversidad alfa en la microbiota de la leche de vacas tratadas con cefalosporinas de tercera generación y mastitis inducida experimentalmente49.En ratones, se sugiere que el tratamiento con antibióticos disminuye la diversidad microbiana55, y se han obtenido resultados similares en humanos56,57,58.
Por lo tanto, primero planteamos la hipótesis de que la dosis de antibiótico y la respuesta de la infección no eran suficientes para regresar a la microbiota residente, aunque como se informó anteriormente, se ha demostrado que la enrofloxacina es viable en el tratamiento de la mastitis1,4,19,51; -La pluralidad de microorganismos puede haber contribuido a la persistencia de la enfermedad.En segundo lugar, planteamos la hipótesis de que los animales sanos (H) tienen una microbiota más específica, y durante la fase en que el animal presenta mastitis se incluyen nuevos microorganismos que generan un aumento en la riqueza de especies;con la llegada del tratamiento antibiótico y la persistencia de la mastitis, esta microbiota vuelve a alterarse, pero no vuelve al marco específico de la fase sana, sino que acaba añadiendo nuevos microorganismos, provocando el mantenimiento del estado clínico de la mastitis y un aumento de la misma. desequilibrio de la microbiota.Este desequilibrio microbiano o diferencia en la composición microbiana se denomina disbiosis59.Este término se define como una alteración de la homeostasis de la microbiota intestinal, o un desequilibrio en la microbiota misma, debido a cambios en la composición funcional y las actividades metabólicas o cambios en la distribución local de los microorganismos residentes en ese nicho particular60,61.El equilibrio homeostático de la microbiota intestinal es extremadamente beneficioso para el huésped62, como debería ocurrir en la leche de la glándula mamaria de las cabras sanas.
Los cuatro filos presentes aquí (Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria) son importantes para la microbiota de la leche de cabra41,42, más específicamente Firmicutes, que tuvo cambios significativos en abundancia entre los grupos (Fig. S2).Los firmicutes también son un grupo importante de bacterias en la leche de vaca25,31,42,63,64, pero aún no se ha determinado su papel específico en el microbioma de la leche.
El género Staphylococcus fue importante en el grupo control sano, aunque en muestras de leche de cabra, este género se relaciona con mayor frecuencia con mastitis por IMI en cabras y ovejas en Brasil65,66 y en todo el mundo26.Sin embargo, en algunos estudios66, este género destaca en las glándulas mamarias sanas de las cabras y también se ha informado que dichas bacterias han sido identificadas en el microbioma sano de la leche de humanos y vacas25,67,68.La leche materna humana, por ejemplo, incluso si se extrae asépticamente de una mujer sana, puede contener S. epidermidis y S. aureus69.
Un estudio de Jácome et al.70 observó infección por el género Staphylococcus en hembras primíparas.Sin embargo, la presencia del género Staphylococcus como nativo de la microbiota autóctona no sería extraña, ya que la presencia de una microbiota autóctona o comensal es fundamental para un buen mantenimiento fisiológico y defensa frente a diferentes patógenos en órganos aparentemente conectados, como el intestino, ojos, oídos y tracto urogenital en humanos71,72, así como el rumen en rumiantes y otros mamíferos terrestres73,74.Por lo tanto, como se ha observado con respecto a la microbiota del tracto intestinal de los humanos, se sugiere que la glándula mamaria animal también parece tener una microbiota residente primaria específica, como se observa en este estudio.
M. haemolytica y S. aureus son las principales causas de mastitis en pequeños rumiantes75.Los géneros Trueperella y Mannheimia demostraron una dominancia casi completa en las muestras en las que estuvieron presentes, antes y después del tratamiento (Fig. 3), y probablemente fueron responsables de la mastitis clínica76.El principal género y especie en relación con cualquier mastitis es M. haemolytica, que causa mastitis clínica, neumonía y septicemia en ovinos77,78.Sin embargo, se han encontrado informes de mastitis caprina subclínica relacionada con este agente79.En Brasil, en el estado de Minas Gerais, se realizó el aislamiento e identificación de la bacteria M. haemolytica como agente causal de neumonía en ovinos80.Se sabe que las especies del género Trueperella son importantes patógenos oportunistas en el ganado y los animales domésticos, y causan una variedad de infecciones81,82, así como mastitis e infecciones uterinas en las vacas83,84.La mastitis causada por T. pyogenes se considera de menor importancia en cabras22,85.
Se identificó el género Fusobacterium con diferencias en abundancia en las muestras M1 y M2.Este género está formado por bacterias Gram negativas anaerobias obligadas86.Sin embargo, muchas fluoroquinolonas se consideran ineficaces contra bacterias anaeróbicas obligadas75.Así, la verdadera razón que llevó a la reducción del género Fusobacterium y al aumento de secuencias de Staphylococcus spp.en la muestra no está claro, pero los mecanismos que utilizan la exclusión competitiva de microorganismos en los microbiomas pueden haber desempeñado un papel en esta reducción87.Fusobacterium spp.se han identificado en gran abundancia en estudios de metagenoma en muestras de leche de vacas diagnosticadas con mastitis clínica25,29.Los estudios metagenómicos utilizando secuenciación shotgun en muestras de mastitis subclínica también han informado la presencia de bacterias anaeróbicas (Fusobacteriales spp., Bacteroidales spp.)88.Fusobacterium necrophorum se detectó con alta prevalencia en muestras de mastitis en vacas y se considera un agente oportunista;sin embargo, las condiciones de crecimiento anaeróbico de este agente han dificultado su aislamiento en métodos de aislamiento estándar en cultivo25,29.
Entre los factores que pueden causar una perturbación en la abundancia89, el uso de antibióticos, en este caso, puede perturbar la comunidad de especies que comúnmente son menos abundantes en condiciones de equilibrio no perturbadas;estas especies pueden volverse más abundantes durante o después de una perturbación y pueden detectarse más fácilmente90.Además, después de una perturbación, los miembros de la comunidad indígena pueden morir (mortalidad) o su abundancia relativa puede cambiar91.Por lo tanto, después del tratamiento con antibióticos, un microbio previamente raro puede aumentar en abundancia para llenar un nicho que había sido dominado por un microbio con mayor sensibilidad a los antibióticos;esto puede conducir a la persistencia del mismo estado estable89.
Estas alteraciones en la microbiota pueden indicar que debemos cambiar la forma en que se trata la mastitis en la cría de animales y que debemos tener en cuenta procedimientos de tratamiento personalizados, como ya ocurre en entornos hospitalarios de humanos92 y animales93.Este tipo de procedimiento, mediante la administración antimicrobiana personalizada, puede disminuir la posible propagación masiva de resistencia en la industria láctea.
Un aumento o disminución del metabolismo del metano, como en este estudio (Fig. S5), siempre ocurre en bacterias anaeróbicas, incluidas Bacteroides spp., lo que induce su aumento o disminución94.Además, el metabolismo del butanoato desempeña un papel fundamental en la prevención y el tratamiento de enfermedades intestinales95.Además, el metabolismo reducido del butanoato y el metabolismo inducido del metano son procesos metabólicos importantes, al igual que el género Bacteroides spp96.Así, asumimos la influencia directa del comportamiento del género Bacteroides sobre las diferencias de estas dos vías metabólicas, lo que sugiere que el aumento del género conduce directamente a un aumento de estas vías, lo que distingue la leche de estos animales enfermos (B y A) del del control sano (H).
Sin embargo, se debe tener cuidado ya que las fluoroquinolonas también son importantes en la terapéutica humana97.Además, puede producirse resistencia cruzada entre la enrofloxacina y otros antimicrobianos de la misma clase que la ciprofloxacina humana98,99.Es necesario prestar atención a la resistencia bacteriana al enrofloxacino6,100,101 y preocupar la presencia de residuos de este fármaco en los alimentos humanos102,103, en el polvo procedente de la ganadería intensiva101 y la diseminación de desechos del ganado para la vida silvestre104.El uso de agentes antimicrobianos en la industria alimentaria puede afectar indiscriminadamente a la salud humana y presenta un alto costo para la sociedad en términos de resistencia a los antimicrobianos;la única manera de evitarlo es velar por su uso sensato 6.105.
En este estudio, demostramos la dinámica de la variación de la microbiota que existe en la leche de la glándula mamaria de cabra cuando ocurre mastitis crónica persistente (PIMI) después del tratamiento ineficaz con el antibiótico enrofloxacino, utilizando la secuenciación del amplicón 16S rRNA.Demostramos la gran abundancia del género Staphylococcus en muestras de animales sanos y planteamos la hipótesis de que es un agente autóctono común, y luego identificamos el filo Firmicutes como divisor entre los grupos.Además, demostramos el predominio de varios géneros previamente conocidos como patógenos de casos de mastitis clínica en cabras, la disimilitud entre las muestras de leche de grupos de animales sanos y las posteriores al tratamiento, y la predicción metabólica de la importancia del metabolismo del metano y butanoato.Futuros estudios más detallados podrían dilucidar qué especies pertenecen a estos géneros y el resistoma actual responsable de la persistencia de la mastitis, detallando más el papel de la microbiota residente frente a la disbiosis y el desarrollo de la RAM.
El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética (Comissão de ética no uso de animais – CEUA) de la Universidad Federal de Viçosa, según protocolo número 43/2016.Los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas.
En este estudio se utilizaron únicamente muestras de animales pertenecientes a un solo rebaño del sector caprino de la Universidad Federal de Viçosa (Viçosa, Minas Gerais, Brasil), que fueron diagnosticados con PIMI y tratados con el antibiótico enrofloxacino, en referencia al estudio realizado. por Lima et al.50, fueron seleccionados.Se seleccionó el grupo control sano y las muestras se recolectaron en el mismo momento y lugar.Se seleccionaron once animales diagnosticados con PIMI y también se seleccionaron tres animales control sanos (H) durante el mismo período.
Los animales diagnosticados con IMI y PIMI fueron evaluados primero para detectar signos de mastitis clínica y la presencia de leche al menos visualmente anormal (es decir, la presencia de escamas, coágulos, sangre o leche serosa), así como cambios en la glándula mamaria, como aumento de volumen y temperatura corporal, y presencia de dolor y enrojecimiento durante el despunte realizado en la sala de ordeño, en presencia de un veterinario.Además, para que los animales sean considerados con PIMI, deberán haber presentado una historia clínica individual con tratamiento antibiótico previo adecuado y un estado clínico de mastitis clínica.
Los prerrequisitos para animales control (H) sanos fueron que los animales presentaran solo primeras gestaciones o fueran primíparas, no presentaran ningún signo de mastitis clínica durante el examen físico ni antecedentes de mastitis.Ninguna de estas cabras tenía antecedentes clínicos de alguna intervención o tratamiento en el que se utilizaran antibióticos intramamarios, inyectables, orales u otros medicamentos que pudieran haber interferido con los resultados de nuestros análisis.Además, sólo se seleccionaron cabras con un cultivo bacteriano negativo.
Todas las muestras que se recolectaron de cada cabra, de ambos cuartos por separado, y se recolectaron antes del tratamiento el día 1, se nombraron antes del tratamiento (B).Las cabras asignadas al tratamiento de IMI recibieron infusiones diarias e intramusculares que contenían enrofloxacina (Kinetomax®, Bayer SA, Brasil) a una dosis de 5 mg/kg cada 24 horas durante siete días.Los animales fueron reexaminados 21 días después de comenzar el tratamiento, y las muestras fueron recolectadas y, por lo tanto, nombradas según el tratamiento (A) y las cabras fueron diagnosticadas con PIMI, mientras que los veterinarios rastrearon su condición médica en las del grupo de control (H)49.Los resultados de las pruebas mediante el método de difusión en disco de Kirby-Bauer fueron la base para la decisión de elegir el tratamiento con enrofloxacino.
Las muestras de leche fueron recolectadas por un veterinario capacitado miembro del equipo de investigación siguiendo las recomendaciones estándar del Manual de laboratorio sobre mastitis bovina del Consejo Nacional de Mastitis106.Para las cabras del grupo tratado con PIMI (A), el muestreo se realizó después del ordeño del cuarto no tratado y se tomó una muestra de la leche inmediatamente antes de aplicar los tratamientos de infusión intramuscular.Para las cabras del grupo IMI (B), el muestreo se realizó en un cuarto con signos clínicos de IMI y se identificó como el mismo que se recolectaría en el grupo PIMI (B).Se recolectaron aproximadamente 15 mL de leche antes del ordeño y después de la limpieza externa del techo con alcohol 70 (alcohol etílico hidratado 70° INPM), descartándose los primeros chorros de leche y secando las ubres del animal individualmente con toallas de papel.Las muestras se refrigeraron inmediatamente a entre 4 y 7 °C, se transportaron al laboratorio en hielo y se procesaron para pruebas microbiológicas en un plazo de seis horas.
Para el aislamiento de las bacterias, se utilizaron muestras de 100 μL de leche prehomogeneizada para un cultivo bacteriológico aeróbico completo y se esparcieron en Columbia Agar suplementado con un 5% de sangre de oveja.Todas las muestras de leche se cultivaron directamente para detectar bacterias aeróbicas utilizando las técnicas de cultivo estándar descritas107,108,109.Las placas se leyeron a las 24, 48 y 72 horas.Las placas que tenían más de tres colonias después de 48 a 72 h de incubación a 37 °C se consideraron positivas a partir de una muestra de leche individual;para las muestras de H, las placas que no demostraron desarrollo bacteriano se consideraron negativas108,110.Además, se almacenó una alícuota de 2 ml de leche a -80 °C hasta su posterior extracción de ADN.
Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos realizadas en este estudio fueron descritas previamente por Lima et al.50.Brevemente, las pruebas de resistencia a los antibióticos se realizaron mediante el método de difusión en disco de Kirby-Bauer, siguiendo las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute111.Se inocularon colonias bacterianas en agar de infusión de cerebro y corazón (Oxoid, Reino Unido) y se incubaron.Se probaron trece antimicrobianos que normalmente se recetan en el tratamiento de la mastitis (ampicilina, neomicina, oxacilina, penicilina G, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, ceftiofur, sulfadiazina + trimetoprima, cefalexina, cefepima y cefaperazona).Las concentraciones inhibidoras mínimas (CMI) para enrofloxacino se realizaron utilizando el método Etest (BioMérieux, Marcy l'Étoile, Francia).Sin embargo, debido a la mastitis aguda y la necesidad de un tratamiento rápido, estos resultados de CMI solo estuvieron disponibles después de completar siete días de tratamiento con enrofloxacina.
El ADN total de las muestras de leche se extrajo utilizando el kit QIAmp DNA min (QIAGEN, Valencia, CA), siguiendo el protocolo de proceso 'Blood or Body Fluid Spin Protocol' (Spin Protocol), con modificaciones descritas por Kuehn et al.64.La concentración y pureza del ADN se cuantificaron mediante espectroscopia (densidad óptica) en un espectrofotómetro científico NanoDrop® Therm Fisher (Waltham, Massachusetts, EE. UU.)29.Las muestras de ADN extraído se enviaron al Laboratorio Nacional Argonne (Lemont, IL, EE. UU.) en una caja isotérmica seca con hielo a -78 °C, debidamente identificadas, para su secuenciación.
En el Laboratorio Argonne (Argonne, IL, EE. UU.), la región hipervariable V4 del gen bacteriano 16S rRNA se amplificó a partir de ADN genómico mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los cebadores 515 F y 806 R optimizados para la plataforma Illumina MiSeq (Illumina Inc., San Diego, CA)112, con el kit de reactivos MiSeq V2.
Las secuencias se demultiplexaron utilizando el programa 'Idemp' (https://github.com/yhwu/idemp).Se utilizó el paquete 'DADA2' (versión 1.8) en R113 para inferir los ASV presentes en cada muestra114.Los métodos ASV han demostrado una sensibilidad y especificidad tan buena o mejor que las unidades taxonómicas operativas (OTU), identificando la distinción de variantes de secuencia en tan solo un nucleótido115.El procesamiento bioinformático siguió en gran medida el tutorial DADA2 (https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html).Los pares de lectura directa e inversa se recortaron y filtraron, se truncaron a 150 nt y la lectura inversa a 150 nt, permitiéndose hasta dos bases de errores ambiguos, y se requirió que cada lectura tuviera menos de dos errores esperados según sus puntajes de calidad.Los ASV se infirieron de forma independiente a partir del avance y el reverso de cada muestra utilizando las tasas de error específicas de la ejecución, y luego se fusionaron los pares de lectura.Se identificaron quimeras para cada muestra y se eliminaron si se identificaron en una fracción suficiente de las muestras mediante el método de consenso.La asignación taxonómica se realizó con la base de datos Silva v132, utilizando la implementación del Clasificador Ribosomal Database Project (RDP), un clasificador bayesiano ingenuo, disponible en el paquete 'DADA2' en R con parámetros predeterminados116,117.También realizamos clasificación con las bases de datos Greengenes versión (13_8)118, HITdb v1.00119 y rdp_train_set_14120 con fines de comparación.Sin embargo, la base de datos Silva clasifica mejor hasta el nivel de género.
A continuación, utilizando el paquete R113 'phyloseq'121, eliminamos cualquier ASV sin una asignación de filo bacteriano, asignado como Archaea, cloroplasto u origen mitocondrial.Para simplificar los análisis posteriores y reducir el ruido de los análisis, aplicamos un umbral de prevalencia y abundancia para ASV bacterianos, en el que los taxones se mantuvieron solo si se encontraron con una frecuencia mínima de 100 en al menos una muestra.No realizamos datos no enrarecidos debido a las características de nuestros datos122,123,124.Los índices de diversidad alfa se exploraron mediante la prueba de análisis de varianza (ANOVA) y análisis de dispersión beta;Las diferencias de Bray-Curtis se calcularon para cada grupo mediante la realización de un escalamiento multidimensional no métrico (NMDS)125 utilizando el paquete 'microbiomeSeq' (https://github.com/umerijaz/microbiomeSeq.git) en R113.Este NMDS fue sometido a permutaciones PERMANOVA126 y 999.Se construyó un diagrama de Venn a partir de la tabla previamente filtrada de ASV con ciertas restricciones de agrupación, de modo que un género en particular se agrupaba si se identificaba más de seis veces en los grupos B, A o H.
Las diferencias de abundancia entre los grupos H, B y A se compararon en el análisis estadístico de perfiles metagenómicos (STAMP)127 mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA)128, seguido de una prueba de Tukey-Kramer con una prueba post hoc (0,95). y el procedimiento Benjamini-Hochberg para controlar la tasa de descubrimiento falso (FDR)129.Se implementaron en STAMP una prueba G bilateral (con Yates)130 y la prueba exacta de Fisher131 para el análisis estadístico de dos muestras132.El grupo de control H se comparó con los grupos B y A mediante la prueba t no paramétrica de White133 utilizando un bootstrap de 0,95.Todos los análisis estadísticos se realizaron y se aceptó significación estadística cuando P <0,05, excepto la prueba G implementada con P <0,01.
Se utilizó el software PICRUSt134 para predecir el contenido de genes funcionales de muestras metagenómicas basándose en secuencias sin procesar del gen marcador de ARNr 16S de los archivos de salida de DADA2.El análisis se realizó en OTU agrupadas con un 97% de similitud seleccionadas usando VSEARCH135 en los paquetes R113, ya que PICRUSt requiere la selección de OTU de referencia cerrada usando la base de datos Greengenes.Las OTU se normalizaron por número de copias y se creó una nueva matriz de categorías funcionales previstas utilizando la base de datos KEGG.Se utilizó el paquete de software STAMP127 para analizar la función metagenómica prevista de las comunidades;de esta manera, se compararon las vías KEGG diferencialmente abundantes en los niveles 2 y 3.Los tres grupos (H, B, A) se compararon mediante un ANOVA seguido de una prueba post hoc de Tukey-Kramer (0,95) y se aceptó significación estadística cuando P <0,05.
Las secuencias de ADN generadas y analizadas durante el estudio actual están disponibles en el repositorio NCBI SRA bajo BioProject PRJNA575577.Otros datos del estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.
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Este estudio fue financiado en parte por la Coordinación de Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior – Brasil (CAPES) – Código de Finanzas 001. Los autores agradecen también el apoyo financiero del CNPq (Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico, Brasilia, Brasil), FAPEMIG (Fundación de Apoyo a la Investigación de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil).María Aparecida Scatamburlo Moreira cuenta con el apoyo del CNPq.
Laboratorio de Enfermedades Bacterianas, Sector de Medicina Veterinaria Preventiva y Salud Pública, Departamento de Veterinaria, Universidad Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil
Richard Costa Polveiro, Ricardo Seiti Yamatogi, Magna Coroa Lima & María Aparecida Scatamburlo Moreira
Centro de Análisis de Biomoléculas (NuBioMol), Centro de Ciencias Biológicas, Universidad Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil
Tiago Antônio de Oliveira Mendes
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RCP concibió el estudio, RCP y MCL realizaron el experimento, RCP, PMPV, TAOM, RSY analizaron los resultados.RCP y MASM escribieron el manuscrito.MASM, PMPV, TAOM, RSY revisaron el manuscrito.
Correspondencia a María Aparecida Scatamburlo Moreira.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
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Polveiro, RC, Vidigal, PMP, Mendes, TAdO et al.Efectos del tratamiento con enrofloxacino sobre la microbiota bacteriana de la leche de cabras con mastitis persistente.Informe científico 10, 4421 (2020).https://doi.org/10.1038/s41598-020-61407-2
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-61407-2
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Inyección de hierro dextrano para aves de caza Informes científicos (Representante científico) ISSN 2045-2322 (en línea)