Хорошо зарекомендовавшие себя методы, используемые в пищевой промышленности, такие как подготовка проб QuEChERS с последующей ЖХ-МС/МС для анализа пестицидов с несколькими остатками, оцениваются для использования с растительным материалом каннабиса. Мы оценили модифицированный метод QuEChERS LC-MS/MS. для анализа пестицидов с несколькими остатками.
Хотя системы выращивания, производства и продажи каннабиса и продуктов, связанных с каннабисом, хорошо развиты, регулирование и обеспечение проведения испытаний на качество и безопасность отстают. Однако правительства штатов и частные лаборатории уделяют особое внимание тестированию безопасности продукции, уделяя особое внимание анализу пестицидов. Этот фокус частично является результатом отзыва различных продуктов, внимания средств массовой информации и беспокойства со стороны групп по защите прав пациентов. Мы оценили модифицированный быстрый, простой, дешевый, эффективный, надежный и безопасный метод подготовки проб (QuEChERS) с последующей жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) для анализа пестицидов с несколькими остатками. Метод QuEChERS Международной ассоциации аналитических сообществ (AOAC) использовался для уменьшенного количества растительного материала на 1,5 г и обрабатывался с помощью универсального состава для дисперсионной твердофазной экстракции (dSPE). В анализе ЖХ-МС/МС использовалась ионизация электрораспылением с переключением постоянной полярности (ESI) и контролировались как минимум два перехода на аналит. Для количественного анализа использовалась калибровка, соответствующая матрице, и использовались внутренние стандарты как метода, так и прибора. Проверка извлечения аналитов проводилась в соответствии с рекомендациями Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (US FDA) путем тестирования трех матриц с тремя уровнями обогащения в трех экземплярах для более чем 200 пестицидов. Для подавляющего большинства пестицидов во всех трех матрицах и на всех трех уровнях обогащения извлечение составило 70–120%. Колонка Для Обнаружения Aspergillus Flavus
Цель работы, описанной в этой статье, — оценить хорошо зарекомендовавшие себя методы, используемые в пищевой промышленности для использования с растительным материалом каннабиса. Жизнеспособность быстрой, простой, дешевой, эффективной, надежной и безопасной подготовки проб (QuEChERS) с помощью анализа жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) была исследована с использованием метода QuEChERS Международной ассоциации аналитических сообществ (AOAC) с модификация стадии гидратации (15). Извлечение около 160 пестицидов было определено на нескольких уровнях обогащения. Наши результаты позволяют получить некоторое представление об общей обнаруживаемости соединений в этой сложной матрице.
Был использован подход к подготовке проб QuEChERS, который хорошо зарекомендовал себя в пищевой промышленности (16). Это универсальный подход, который хорошо подходит для анализа множественных остатков пестицидов в различных товарах. QuEChERS обеспечивает «достаточно хорошую» очистку проб для анализа, как качественного, так и количественного, в сочетании с высокочувствительными и селективными методами анализа, такими как газовая хроматография (ГХ) и ЖХ-МС/МС. QuEChERS гораздо менее ресурсоемок, чем ранее использовавшиеся методы, он эффективен и совместим со многими матрицами, аналитами, а также анализами ГХ и ЖХ. Хотя каннабис представляет собой ряд уникальных проблем, существует прецедент модификации типичных методов QuEChERS для работы с товарами с низким содержанием воды (17–19).
Раствор для обогащения пестицидов в концентрации 10 ppm в 0,1% муравьиной кислоте в ацетонитриле был приготовлен путем объединения 10 исходных растворов (Restek Corporation) непосредственно перед использованием. В качестве внутренних стандартов метода использовали шесть дейтерированных пестицидов путем добавления 75 мкл раствора с концентрацией 10 ppm в начале подготовки проб. Пестициды включали атразин-d5, диазинон-d10, дихлофос-d6, диметоат-d6, диурон-d6 и линурон-d6 и объединялись из отдельных исходных растворов при концентрации 100 ppm в ацетонитриле (Корпорация "Рестек"). Линурон-д6 был внутренним стандартом, используемым для количественных расчетов. Другие внутренние стандарты были проанализированы на случай, если данные linuron-d6 были скомпрометированы. Добавление 5 мкл (10 мкг/мл) карбарила-d7 (Restek Corporation) в 0,1% растворе муравьиной кислоты в ацетонитриле на 1 мл экстракта образца использовали в качестве аналитического внутреннего стандарта для контроля производительности прибора.
Сыпучий материал осторожно перемешивали в мешке для хранения, а затем порции по 1,5 г отвешивали в центрифужные пробирки емкостью 50 мл. Два 3/8 дюйма. В каждую пробирку добавляли шарики из нержавеющей стали и материал гомогенизировали в течение 5 минут при 1500 об/мин с использованием тканевого гомогенизатора SPEX Geno/Grinder (SPEX SamplePrep). Затем добавляли 15 мл воды, пригодной для ЖХ-МС, и 75 мкл шестикомпонентной смеси дейтерированных пестицидов с концентрацией 10 ppm. Пестициды добавляли в концентрации 1000 нг/г (ppb) путем добавления 150 мкл раствора для внесения пестицидов с концентрацией 10 нг/мкл, 200 нг/г (ppb) путем добавления 30 мкл раствора для внесения пестицидов с концентрацией 10 нг/мкл или 50 нг /г (частей на миллиард) путем добавления 7,5 мкл раствора для добавления пестицидов с концентрацией 10 нг/мкл. Эти уровни соответствуют концентрациям инъекции 100, 20 и 5 пг/мкл (частей на миллиард) после подготовки пробы. Необогащенные образцы были обработаны для определения содержания пестицидов и получения калибровочных стандартов, соответствующих матрице.
Для извлечения образцов использовался метод AOAC QuEChERS (15). После обогащения пестицидами к гомогенизированному и гидратированному образцу добавляли 15 мл ацетонитрила с 1% уксусной кислоты. После 1-минутного встряхивания в гомогенизаторе тканей (1500 об/мин) образцу давали возможность экстрагироваться в течение 30 минут при периодическом ручном встряхивании. Это увеличенное время экстракции использовали для того, чтобы дать время для гидратации и экстракции сухого материала. Добавляли буферные соли, содержащие 6 г сульфата магния и 1,5 г ацетата натрия (Restek Corporation). После 1-минутного встряхивания руки образец центрифугировали в течение 5 минут с усилием 3000 g. Верхний слой ацетонитрила удаляли в чистый флакон. Фотографии этапов экстракции показаны на рисунке 1а.
Экстракты очищали методом дисперсионной твердофазной экстракции (дТФЭ), состоящей из рыхлого сорбента в пробирках. Сорбент первичных вторичных аминов (ПСА) удаляет совместно экстрагированные соединения, такие как сахара, жирные кислоты и каннабиноиды. Следует отметить, что удаление каннабиноидов при этом методе не имеет существенного значения из-за высокого массового содержания каннабиноидов и относительно низкой сорбирующей способности. Сорбент С18 удаляет неполярные компоненты матрицы, а графитированная сажа (ГЦБ) восстанавливает пигменты и стерины. Сульфат магния удаляет следовые количества воды из конечного ацетонитрильного экстракта. Использовали рецептуру дТФЭ, называемую универсальной, с содержанием 50 мг сорбента ПСА, 50 мг сорбента С18, 7,5 мг сорбента ГЦБ и 150 мг MgSO4 на миллилитр экстракта (Корпорация "Рестек"). Обогащенные образцы очищали с использованием пробирки для дТФЭ на 1 мл экстракта. Пробирку объемом 15 мл использовали для очистки 8 мл экстракта необогащенных образцов, чтобы получить достаточный объем для калибровочных стандартов, соответствующих матрице; однако соотношение количества сорбента и объема экстракта было одинаковым. Пробирки встряхивали вручную в течение 2 минут и центрифугировали в течение 5 минут. После того, как 500 мкл экстракта поместили во флакон с одноступенчатым стандартным фильтром Thomson (0,2 мкм, Restek Corporation), 5 мкл 5% муравьиной кислоты в растворе ацетонитрила и 2,5 мкл 10 ppm карбарила-d7 в 0,1% муравьиной кислоте. в раствор ацетонитрила. Примеры извлечения до и после dSPE показаны на рисунке 1b.
Анализ ЖХ-МС/МС проводили с использованием системы Shimadzu LCMS-8050 с системой Prominence HPLC (Shimadzu Scientific Instruments). Колонку Raptor ARC-18 размером 100 мм x 2,1 мм и 3 мкм, оснащенную колонкой Raptor ARC-18 Guard, размещенной в держателе EXP Direct Connect (Restek Corporation), использовали со скоростью потока 0,5 мл/мин. Температуру колонки поддерживали на уровне 40 °C, а температуру автосамплера — на уровне 15 °C. Программа градиента начиналась с 90% водного раствора, содержащего 5 мМ формиата аммония, 0,1% муравьиной кислоты и 10% метанола. Эту композицию подвижной фазы выдерживали в течение 1,50 мин, постепенно увеличивали и достигли 37% 5 мМ формиата аммония с 0,1% раствором муравьиной кислоты и 63% метанола за 5,50 мин. Следующим шагом было линейное увеличение до 25% 5 мМ формиата аммония с 0,1% раствором муравьиной кислоты и 75% метанола за 9,00 мин, затем постепенное повышение до 100% метанола за 10,00 мин, где оно удерживалось в течение 2 мин. Колонку повторно уравновешивали в течение 3 минут при исходных условиях подвижной фазы, в результате чего время анализа составило 15 минут. Мы использовали инъекцию 1 мкл, чтобы улучшить форму пиков рано элюируемого пестицида, поскольку растворителем для экстракции был подкисленный ацетонитрил, а исходной подвижной фазой была в основном вода. Этот подход также поддерживал чистоту колонок и инструментов и позволял выполнять множество инъекций до того, как потребуется техническое обслуживание. Время удерживания и переходы мониторинга множественных реакций (MRM) для выбранных соединений можно найти в Таблице I. Эти соединения были названы в постановлениях и руководствах штатов Орегона, Вашингтона, Невады и Массачусетса (13).
Параметры источника ионов масс-спектрометра были следующими: температура интерфейса – 300 °С; напряжение 4 кВ (положительный режим) и -3 кВ (отрицательный режим); распыляющий газ, 2 л/мин; отопительный газ, 10 л/мин; осушающий газ, 10 л/мин; температура ДЛ, 250°С; Температура ГБ, 400 °С; ударный газ аргон при 270 кПа; Режим MRM с окном обнаружения 48 с и временем цикла 750 мс. Энергия столкновения была оптимизирована для типичных соединений и указана в Таблице I. Ионизация электрораспылением с режимом непрерывного переключения полярности, который получает как положительные, так и отрицательные данные ионизации электрораспылением (ESI), применялась так, чтобы все соединения были обнаружены в одном анализе. Для каждого аналита контролировали один количественный переход МС/МС и по меньшей мере один квалификационный переход. Ионное соотношение квалификатора – количественные ионы сравнивали с соотношением ионов, определенным по стандартам растворителей. Идентификация соединения подтверждалась, если экспериментальное соотношение ионов находилось в пределах 30% (относительно) от известного соотношения ионов.
Было оценено около 470 калибровочных кривых (3 матрицы х 158 соединений). Примерно 95% калибровочных кривых, соответствующих матрице, показали значения r2 0,99 или выше. Наименьшее наблюдаемое значение r2 составило 0,94 для трех кривых. Соединения с более низкими значениями r2 не были одинаковыми в трех протестированных матрицах. Однако хлорантранилипрол, флудиоксонил, абамектин B1a, бупиримат и изомер 1 клетодима имели значения r2 менее 0,99 для двух из трех матриц. Апельсиновый куш, голландское лакомство и композит содержали два, девять и 12 соединений соответственно с калибровочными кривыми с r2 < 0,99.
Сводные результаты извлечения (%) и относительное стандартное отклонение (RSD, %) пестицидов, обогащенных в пустых матрицах растительного материала каннабиса в концентрации 50, 200 и 1000 нг/г и экстрагированных с использованием метода, описанного выше, показаны на рисунках 2 и 3. Среднее значение восстановление и RSD для соединений с тройным добавлением образцов (n = 3) на каждом уровне и для всех трех матриц, а также среднее значение и RSD всех образцов на этом уровне добавления (n = 9) для выбранных соединений можно найти в Таблицах II. –IV. Критерии соотношения ионов не были соблюдены или в некоторых случаях сигнал отсутствовал, и эти результаты указаны ниже предела обнаружения (<DL) в таблицах II–IV, что привело к неполному набору данных. Это произошло для шести соединений с самым низким уровнем обогащения, то есть с концентрацией для инъекции 5 частей на миллиард, и для абамектина B1a со средним уровнем обогащения. Абамектин, широко известный под торговым названием Avid, является популярным инсектицидом, используемым для лечения паутинного клеща, распространенного вредителя каннабиса. Абамектин чувствителен к нагреванию, поэтому горячий интерфейс ЖХ-МС/МС, используемый для других пестицидов, вероятно, привел к снижению сигнала абамектина. Абамектин можно протестировать с различными параметрами интерфейса ЖХ-МС/МС, чтобы получить максимальный сигнал и обнаружить его на низких уровнях.
Желательный диапазон извлечения был определен как составляющий от 70% до 120%. Этот диапазон восстановления обычно считается удовлетворительным в пищевой промышленности. Процент соединений в диапазонах восстановления ниже 70%, 70–120% и выше 120%, а также процент соединений, не обнаруженных для каждого уровня обогащения (n = 9), показаны на рисунке 2. Для самого низкого уровня пика , 50 нг/г, 144 пестицида из 158, или 91%, попали в этот диапазон восстановления 70–120%. Одно соединение, флоникамид, показало извлечение выше 120% (123%, 11% RSD), семь соединений показали извлечение ниже 70%, а шесть соединений не были обнаружены (см. Таблицу II). При уровне обогащения 200 нг/г 148 из 158 соединений, примерно 93%, были извлечены в желаемом диапазоне, ни одно соединение не достигло уровня извлечения выше 120%, девять соединений показали восстановление ниже 70%, а абамектин B1a не был обнаружен. (см. Таблицу III). При самом высоком уровне пика, 1000 нг/г, 150 соединений из 158 были извлечены в диапазоне 70–120%, а восемь соединений были извлечены ниже 70% (см. Таблицу IV).
Соединения с низкой степенью извлечения (менее 70%) показали менее желательную степень восстановления на всех уровнях пиков и в матрицах. Спиносад А и спиносад D показали несколько более низкую степень извлечения, но эти значения восстановления в целом совпадают. Спироксамин также показал более низкую степень восстановления и был более вариабельным. Эти соединения являются слабоосновными, и степень извлечения может быть ниже, чем у других пестицидов, из-за кислых условий экстракции, используемых при подготовке проб. Возможно, для этих соединений более подходящим будет некислотный метод QuEChERS. Соединения с низким, но воспроизводимым восстановлением включали эмамектин B1a, феназакин, фенбуконазол и спинеторам. Имазалил и тидиазурон показали плохое и невоспроизводимое выздоровление.
На рисунке 3 показан процент пестицидов со значениями RSD ≤20%, >20% и не обнаруженных (ND) на каждом уровне всплеска. Извлечение считалось воспроизводимым для пестицида на этом уровне обогащения, когда RSD ≤20% достигалось для всех трех матриц (n = 9). Неудивительно, что количество необнаруженных аналитов было самым высоким при самом низком уровне пика, соответствующем 5 пг, введенным в колонку, как показано на рисунках 2 и 3. Все аналиты были обнаружены при самом высоком уровне обогащения, соответствующем 100 пг, введенным в колонку. столбец. Та же тенденция наблюдалась и для соединений с более высоким, чем желательно, RSD извлечения. Самый низкий уровень обогащения показал примерно 6% (девять пестицидов) с RSD >20%, пик среднего уровня показал снижение примерно до 4% (шесть соединений), а самый высокий уровень пика показал только 1% (два соединения) с RSD. >20%. Ни одно соединение, показавшее значения RSD выше желаемого, не было общим для всех трех уровней пиков. В большинстве случаев ОСО менее 20% достигалось для каждой матрицы (n = 3) при заданном уровне всплеска, но усреднение восстановления по трем матрицам приводило к ОСО > 20% (n = 9). Эти результаты показывают, что каждая матрица для этих соединений по-разному влияет на извлечение и количественный анализ. По всем трем матрицам и уровням обогащения (n = 27) большинство соединений были воспроизводимо извлечены с RSD ≤20%.
В целом, этот метод оказался подходящим для анализа множественных остатков пестицидов в каннабисе, о чем свидетельствуют приемлемое извлечение и RSD почти всех из почти 160 протестированных пестицидов. Некоторые протестированные пестициды чувствительны к кислотам, и использование оригинальных, небуферных или европейских методов EN 15662 могло бы улучшить извлечение этих соединений. Обнаруживаемость большинства соединений была достаточной, а количественный анализ с использованием калибровки по матрице был важен из-за сложности матриц каннабиса и высокого содержания каннабиноидов, которые оставались в конечном экстракте. Метод был трудным в первую очередь из-за удаления пигмента и использования небольшого объема инъекции. Используя этот метод, анализ пестицидов с несколькими остатками в растительном материале каннабиса оказался успешным с использованием простого и недорогого подхода QuEChERS в сочетании с чувствительным анализом ЖХ-МС/МС.
К. Мастовска и др., J. Agric. Пищевая хим. 58(10), 5959–72 (2010). П. Роджер Фолькер и П. Маугли Холмс, «Использование пестицидов в каннабисе», Институт безопасности каннабиса (2015 г.), доступно по адресу: http://cannabissafetyinstitute.org/wp-content/uploads/2015/06/CSI-Pesticides-White. -Бумага.pdf.
Джули Ковальски раньше работала в Restek Corporation в Беллефонте, штат Пенсильвания, а сейчас работает в Trace Analytics в Спокане, штат Вашингтон. Джеффри Х. Даль работает в компании Shimadzu Scientific Instruments в Колумбии, штат Мэриленд. Аманда Ригдон работает в Emerald Scientific в Сан-Луис-Обиспо, Калифорния. Джек Кокран работает в VUV Analytics в Сидар-Парке, штат Техас. Дерек Лейн и Гордон Фаграс из Trace Analytics. Прямая переписка по адресу: Julie@traceanalytics.com.